空间多组学揭示结直肠癌中C1QC+巨噬细胞-CD4+ T细胞生态位及其对免疫治疗的启示

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研究背景
结直肠癌（CRC）是全球范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤。免疫检查点抑制剂（ICIs）的应用虽为部分患者带来希望，但其疗效在群体中呈现显著异质性：微卫星高度不稳定（MSI-H）型患者中仍有近半数无应答，而占绝大多数的微卫星稳定（MSS）型患者通常表现原发性耐药。学界逐渐认识到，肿瘤微环境（TME）的细胞构成，尤其是其空间拓扑结构，是决定免疫治疗成败的关键。
2025年7月1日，浙江大学医学院包暄文、方维佳与西湖大学医学院郭天南作为共同通讯作者在Cell Discovery上发表了题为 “Spatially resolved C1QC+ macrophage-CD4+ T cell niche in colorectal cancer microenvironment: implications for immunotherapy response” 的研究论文。本研究采用了一种综合方法，结合成像质谱流式技术、空间转录组学、空间蛋白质组学、单细胞RNA测序、蛋白质组学及转录组测序，在单细胞水平上构建了接受免疫治疗的转移性结直肠癌患者空间免疫图谱的全面分析，提供了高通量的空间表型信息。通过运用先进的深度学习方法，深入探究了结直肠癌的空间拓扑结构，并揭示了其免疫治疗耐药性的潜在作用机制。

文章标题

研究设计与多队列整合
研究共纳入六个队列：
队列1（内部核心发现队列）：包含25名接受免疫治疗的mCRC患者（16名MSS，9名MSI），在治疗前收集样本，并对同一组织区域同时进行成像质谱流式（IMC, 50个ROI） 和配对的空间蛋白组学（50个ROI） 分析，实现了细胞表型与深层分子功能的精准关联。
队列2（内部空间验证队列）：一个独立的包含9名mCRC患者的队列，进行空间转录组学分析，旨在全切片水平上验证核心发现。
队列3（外部scRNA-seq队列）：来自已发表研究的27个MSI CRC样本的单细胞RNA测序数据，用于在单细胞分辨率下验证细胞亚群的身份、分子特征及功能状态。
队列4（外部转录组队列）：包含31名接受新辅助免疫治疗的MSI CRC患者的RNA-seq数据，用于评估基于C1QC+ RTMs特征的预测效能。
队列5（整合外部空间转录组队列）：整合了7个已发表的CRC空间转录组数据集，作为独立的公共资源，进一步验证细胞空间共定位模式的普适性。
队列6（内部蛋白组队列）：114名初治CRC患者的批量蛋白质组数据，用于在蛋白质层面验证C1QC+ RTMs特征与关键生物学通路（如抗原呈递）的相关性。
患者分层：根据临床疗效将患者分为四个关键亚组：MSS应答者（MSS_R）、MSS非应答者（MSS_NR）、MSI应答者（MSI_R）和MSI非应答者（MSI_NR），从而能够独立于MSI状态寻找共性的应答机制。

图1 研究概述

研究结论
结论1：空间免疫图谱鉴定出C1QC+巨噬细胞与成纤维细胞为关键预测细胞
通过对队列1的IMC数据进行系统性分析，研究团队在314,774个单细胞水平构建了结直肠癌的空间免疫图谱（Fig. 2a-d）。这一高维空间分析揭示了一个关键现象：C1QC+组织驻留巨噬细胞（RTMs）在免疫治疗应答者中显著富集，而成纤维细胞则在非应答者中明显增多（Fig. 2e, f）。值得注意的是，这一发现完全独立于MSI状态，在MSS和MSI亚型中均表现一致，提示我们可能发现了一个超越传统分子分型的普适性免疫治疗预测标志物。为了进一步验证这一发现，研究团队采用了ResNet18深度学习模型对IMC图像进行深度挖掘，结果显示C1QC和胶原蛋白I（成纤维细胞标志）是区分患者应答状态的最重要特征（Fig. 2i），从计算生物学角度佐证了这一发现的可靠性。这一发现为临床实践中筛选免疫治疗潜在获益人群提供了新的思路。

Figure 2 结直细胞癌患者MSS/MSI_R和NR的单细胞分辨率空间免疫表型

结论2：空间拓扑分析揭示功能性细胞生态位与物理屏障

通过细胞邻域分析，研究团队识别出15个具有独特细胞组成的空间功能单元（Fig. 3c, d）。其中，富含C1QC+ RTMs和CD4+ T细胞的CN1在MSI应答者中特异性富集，这一现象提示我们这可能是一个功能性的免疫激活微环境。进一步的空间相互作用分析显示，在应答者中，C1QC+ RTMs与CD4+ T细胞的空间距离显著缩短，相互作用明显增强（Fig. 3e, f）。更重要的是，这种空间邻近性具有明确的功能意义：位于C1QC+ RTMs附近的CD4+ T细胞高表达多种激活标志物，包括CD38、CD57、GZMB、TNFα和PD-1（Fig. 3g），表明这些T细胞处于高度活化状态。相反，在非应答者中，成纤维细胞通过形成物理屏障，有效阻断了C1QC+ RTMs与CD4+ T细胞之间的空间连接，其计算的"屏障分数"显著更高。这一发现揭示了肿瘤微环境中不同细胞类型之间复杂的空间博弈关系。

Figure 3 结直肠癌患者MSS/MSI_R和NR的空间细胞邻近关系及细胞间距离表型分析

结论3：单细胞与空间转录组证实C1QC+ RTMs通过MHC-II信号激活T细胞
为了深入解析C1QC+ RTMs的分子特征和功能机制，研究团队对公共数据库中的scRNA-seq数据进行了深度挖掘（Fig. 4j, k）。分析结果显示，C1QC+ RTMs显著高表达MHC-II类分子，其核心生物学功能富集于抗原处理与呈递通路。这一发现从转录组层面揭示了该细胞亚群的专业抗原呈递细胞特性。进一步的细胞通讯分析发现，在免疫治疗应答者中，C1QC+ RTMs与CD4+ T细胞之间由HLA-DR分子介导的相互作用网络显著增强。这种增强的通讯模式不仅体现在信号通路强度上，还表现在配体-受体对的多样性上，形成了一个密集的免疫调控网络。这些发现从分子机制层面解释了C1QC+ RTMs如何通过经典的MHC-II途径激活CD4+ T细胞，从而驱动抗肿瘤免疫应答。

Figure 4 C1QC+ RTM通过MHC II类信号通路介导免疫激活

结论4：空间蛋白组学在分子功能层面提供决定性证据
本研究的重要部分在于应用了配对的空间蛋白组学分析技术。通过使用组织膨胀与高灵敏度质谱的结合（Supplementary Fig. S20a），即FAXP技术，使研究团队能够在蛋白质层面解析关键的分子特征。首先，在MSS应答者组织中，"抗原通过MHC-II处理"通路在蛋白质水平显著富集（Fig. 5a-c），这与转录组层面的发现形成了完美呼应。更为重要的是，C1QC+ RTMs的蛋白特征评分与MHC-II分子表达水平呈现强正相关（R=0.54），这一相关性在独立的批量蛋白组数据集中得到验证（R=0.46）。此外，研究还发现应答者组织中多个免疫治疗相关通路在蛋白水平被特异性激活，包括T细胞受体信号、干扰素-γ信号、IL-12/STAT4信号等（Fig. 5d）。这些发现从功能蛋白质组学层面为C1QC+ RTMs的抗原呈递功能提供了最直接的证据。

Figure S20 FAXP™工作流程图

Figure 5 配对空间分辨率蛋白质组学证实，C1QC+常驻组织巨噬细胞在免疫治疗中发挥抗原呈递作用

结论5：全基因组筛选发现调控抗原呈递的关键靶点
为了探索增强巨噬细胞抗原呈递功能的潜在治疗策略，研究团队进行了CRISPR-Cas9全基因组筛选（Fig. 6c）。这一系统性筛选成功鉴定出多个调控巨噬细胞MHC-II表达的关键基因，其中孤儿核受体ESRRA被验证为重要的负向调控因子。在THP-1细胞模型中的功能验证实验显示，敲除ESRRA可显著提升巨噬细胞在极化过程中的MHC-II表达水平（Fig. 6g, h）。这一发现不仅揭示了调控巨噬细胞抗原呈递功能的关键分子开关，更重要的是为临床开发新的联合治疗策略提供了潜在靶点。通过药物干预ESRRA，可能能够增强肿瘤相关巨噬细胞的抗原呈递能力，从而改善免疫治疗疗效。

Figure 6 全基因组筛选检测发现C1QC+常驻组织巨噬细胞中存在调控抗原呈递细胞功能的潜在相关通路

结论6：跨平台与跨癌种验证
为了确保研究发现的普适性和可靠性，研究团队进行了多层次的验证。首先，通过空间转录组学分析（队列2和5），在更大的组织范围内验证了C1QC+ RTMs与CD4+ T细胞的空间共定位现象。同时，多色免疫荧光实验也从蛋白质水平证实了这一发现。更重要的是，研究团队对18个公共数据集进行了荟萃分析，涵盖非小细胞肺癌、皮肤黑色素瘤、乳腺癌、食管癌、尿路上皮癌、肾细胞癌和胃腺癌等多个癌种。分析结果显示，C1QC+ RTMs的浸润与更好的免疫治疗反应和更长的患者生存期显著相关，这一发现提示C1QC+ RTMs可能作为一个跨癌种的通用生物标志物，具有重要的临床转化价值。这些跨平台、跨癌种的验证工作极大地增强了研究结论的可靠性和普适性。
总结与展望
本研究通过空间多组学深度剖析，揭示了CRC免疫治疗响应的关键空间决定因素：C1QC+ RTMs通过与CD4+ T细胞形成空间生态位，并通过高表达MHC-II分子增强抗原呈递，从而驱动抗肿瘤免疫。反之，成纤维细胞的空间屏障作用是导致耐药的重要原因。研究构建的“空间免疫图谱”为理解TME提供了新视角，鉴定出的C1QC+ RTMs和成纤维细胞为联合治疗策略（如靶向成纤维细胞）的开发提供了新的理论基础。
研究背景
结直肠癌（CRC）是全球范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤。免疫检查点抑制剂（ICIs）的应用虽为部分患者带来希望，但其疗效在群体中呈现显著异质性：微卫星高度不稳定（MSI-H）型患者中仍有近半数无应答，而占绝大多数的微卫星稳定（MSS）型患者通常表现原发性耐药。学界逐渐认识到，肿瘤微环境（TME）的细胞构成，尤其是其空间拓扑结构，是决定免疫治疗成败的关键。
2025年7月1日，浙江大学医学院包暄文、方维佳与西湖大学医学院郭天南作为共同通讯作者在Cell Discovery上发表了题为 “Spatially resolved C1QC+ macrophage-CD4+ T cell niche in colorectal cancer microenvironment: implications for immunotherapy response” 的研究论文。本研究采用了一种综合方法，结合成像质谱流式技术、空间转录组学、空间蛋白质组学、单细胞RNA测序、蛋白质组学及转录组测序，在单细胞水平上构建了接受免疫治疗的转移性结直肠癌患者空间免疫图谱的全面分析，提供了高通量的空间表型信息。通过运用先进的深度学习方法，深入探究了结直肠癌的空间拓扑结构，并揭示了其免疫治疗耐药性的潜在作用机制。

文章标题

研究设计与多队列整合
研究共纳入六个队列：
队列1（内部核心发现队列）：包含25名接受免疫治疗的mCRC患者（16名MSS，9名MSI），在治疗前收集样本，并对同一组织区域同时进行成像质谱流式（IMC, 50个ROI） 和配对的空间蛋白组学（50个ROI） 分析，实现了细胞表型与深层分子功能的精准关联。
队列2（内部空间验证队列）：一个独立的包含9名mCRC患者的队列，进行空间转录组学分析，旨在全切片水平上验证核心发现。
队列3（外部scRNA-seq队列）：来自已发表研究的27个MSI CRC样本的单细胞RNA测序数据，用于在单细胞分辨率下验证细胞亚群的身份、分子特征及功能状态。
队列4（外部转录组队列）：包含31名接受新辅助免疫治疗的MSI CRC患者的RNA-seq数据，用于评估基于C1QC+ RTMs特征的预测效能。
队列5（整合外部空间转录组队列）：整合了7个已发表的CRC空间转录组数据集，作为独立的公共资源，进一步验证细胞空间共定位模式的普适性。
队列6（内部蛋白组队列）：114名初治CRC患者的批量蛋白质组数据，用于在蛋白质层面验证C1QC+ RTMs特征与关键生物学通路（如抗原呈递）的相关性。
患者分层：根据临床疗效将患者分为四个关键亚组：MSS应答者（MSS_R）、MSS非应答者（MSS_NR）、MSI应答者（MSI_R）和MSI非应答者（MSI_NR），从而能够独立于MSI状态寻找共性的应答机制。

图1 研究概述

研究结论
结论1：空间免疫图谱鉴定出C1QC+巨噬细胞与成纤维细胞为关键预测细胞
通过对队列1的IMC数据进行系统性分析，研究团队在314,774个单细胞水平构建了结直肠癌的空间免疫图谱（Fig. 2a-d）。这一高维空间分析揭示了一个关键现象：C1QC+组织驻留巨噬细胞（RTMs）在免疫治疗应答者中显著富集，而成纤维细胞则在非应答者中明显增多（Fig. 2e, f）。值得注意的是，这一发现完全独立于MSI状态，在MSS和MSI亚型中均表现一致，提示我们可能发现了一个超越传统分子分型的普适性免疫治疗预测标志物。为了进一步验证这一发现，研究团队采用了ResNet18深度学习模型对IMC图像进行深度挖掘，结果显示C1QC和胶原蛋白I（成纤维细胞标志）是区分患者应答状态的最重要特征（Fig. 2i），从计算生物学角度佐证了这一发现的可靠性。这一发现为临床实践中筛选免疫治疗潜在获益人群提供了新的思路。

Figure 2 结直细胞癌患者MSS/MSI_R和NR的单细胞分辨率空间免疫表型

结论2：空间拓扑分析揭示功能性细胞生态位与物理屏障

通过细胞邻域分析，研究团队识别出15个具有独特细胞组成的空间功能单元（Fig. 3c, d）。其中，富含C1QC+ RTMs和CD4+ T细胞的CN1在MSI应答者中特异性富集，这一现象提示我们这可能是一个功能性的免疫激活微环境。进一步的空间相互作用分析显示，在应答者中，C1QC+ RTMs与CD4+ T细胞的空间距离显著缩短，相互作用明显增强（Fig. 3e, f）。更重要的是，这种空间邻近性具有明确的功能意义：位于C1QC+ RTMs附近的CD4+ T细胞高表达多种激活标志物，包括CD38、CD57、GZMB、TNFα和PD-1（Fig. 3g），表明这些T细胞处于高度活化状态。相反，在非应答者中，成纤维细胞通过形成物理屏障，有效阻断了C1QC+ RTMs与CD4+ T细胞之间的空间连接，其计算的"屏障分数"显著更高。这一发现揭示了肿瘤微环境中不同细胞类型之间复杂的空间博弈关系。

Figure 3 结直肠癌患者MSS/MSI_R和NR的空间细胞邻近关系及细胞间距离表型分析

结论3：单细胞与空间转录组证实C1QC+ RTMs通过MHC-II信号激活T细胞
为了深入解析C1QC+ RTMs的分子特征和功能机制，研究团队对公共数据库中的scRNA-seq数据进行了深度挖掘（Fig. 4j, k）。分析结果显示，C1QC+ RTMs显著高表达MHC-II类分子，其核心生物学功能富集于抗原处理与呈递通路。这一发现从转录组层面揭示了该细胞亚群的专业抗原呈递细胞特性。进一步的细胞通讯分析发现，在免疫治疗应答者中，C1QC+ RTMs与CD4+ T细胞之间由HLA-DR分子介导的相互作用网络显著增强。这种增强的通讯模式不仅体现在信号通路强度上，还表现在配体-受体对的多样性上，形成了一个密集的免疫调控网络。这些发现从分子机制层面解释了C1QC+ RTMs如何通过经典的MHC-II途径激活CD4+ T细胞，从而驱动抗肿瘤免疫应答。

Figure 4 C1QC+ RTM通过MHC II类信号通路介导免疫激活

结论4：空间蛋白组学在分子功能层面提供决定性证据
本研究的重要部分在于应用了配对的空间蛋白组学分析技术。通过使用组织膨胀与高灵敏度质谱的结合（Supplementary Fig. S20a），即FAXP技术，使研究团队能够在蛋白质层面解析关键的分子特征。首先，在MSS应答者组织中，"抗原通过MHC-II处理"通路在蛋白质水平显著富集（Fig. 5a-c），这与转录组层面的发现形成了完美呼应。更为重要的是，C1QC+ RTMs的蛋白特征评分与MHC-II分子表达水平呈现强正相关（R=0.54），这一相关性在独立的批量蛋白组数据集中得到验证（R=0.46）。此外，研究还发现应答者组织中多个免疫治疗相关通路在蛋白水平被特异性激活，包括T细胞受体信号、干扰素-γ信号、IL-12/STAT4信号等（Fig. 5d）。这些发现从功能蛋白质组学层面为C1QC+ RTMs的抗原呈递功能提供了最直接的证据。

Figure S20 FAXP™工作流程图

Figure 5 配对空间分辨率蛋白质组学证实，C1QC+常驻组织巨噬细胞在免疫治疗中发挥抗原呈递作用

结论5：全基因组筛选发现调控抗原呈递的关键靶点
为了探索增强巨噬细胞抗原呈递功能的潜在治疗策略，研究团队进行了CRISPR-Cas9全基因组筛选（Fig. 6c）。这一系统性筛选成功鉴定出多个调控巨噬细胞MHC-II表达的关键基因，其中孤儿核受体ESRRA被验证为重要的负向调控因子。在THP-1细胞模型中的功能验证实验显示，敲除ESRRA可显著提升巨噬细胞在极化过程中的MHC-II表达水平（Fig. 6g, h）。这一发现不仅揭示了调控巨噬细胞抗原呈递功能的关键分子开关，更重要的是为临床开发新的联合治疗策略提供了潜在靶点。通过药物干预ESRRA，可能能够增强肿瘤相关巨噬细胞的抗原呈递能力，从而改善免疫治疗疗效。

Figure 6 全基因组筛选检测发现C1QC+常驻组织巨噬细胞中存在调控抗原呈递细胞功能的潜在相关通路

结论6：跨平台与跨癌种验证
为了确保研究发现的普适性和可靠性，研究团队进行了多层次的验证。首先，通过空间转录组学分析（队列2和5），在更大的组织范围内验证了C1QC+ RTMs与CD4+ T细胞的空间共定位现象。同时，多色免疫荧光实验也从蛋白质水平证实了这一发现。更重要的是，研究团队对18个公共数据集进行了荟萃分析，涵盖非小细胞肺癌、皮肤黑色素瘤、乳腺癌、食管癌、尿路上皮癌、肾细胞癌和胃腺癌等多个癌种。分析结果显示，C1QC+ RTMs的浸润与更好的免疫治疗反应和更长的患者生存期显著相关，这一发现提示C1QC+ RTMs可能作为一个跨癌种的通用生物标志物，具有重要的临床转化价值。这些跨平台、跨癌种的验证工作极大地增强了研究结论的可靠性和普适性。
总结与展望
本研究通过空间多组学深度剖析，揭示了CRC免疫治疗响应的关键空间决定因素：C1QC+ RTMs通过与CD4+ T细胞形成空间生态位，并通过高表达MHC-II分子增强抗原呈递，从而驱动抗肿瘤免疫。反之，成纤维细胞的空间屏障作用是导致耐药的重要原因。研究构建的“空间免疫图谱”为理解TME提供了新视角，鉴定出的C1QC+ RTMs和成纤维细胞为联合治疗策略（如靶向成纤维细胞）的开发提供了新的理论基础。
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