蛋白质组进展简报|肠道微生物;体液蛋白质组学;小鼠组织的PPI

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肠道微生物多组学研究

图源:论文截图

Mann课题组参与的最新肠道微生物多组学的研究论文,5月10日在Nature杂志上线。

这篇论文的巧妙的点是,开发了一个ph依赖的取材装置,可以根据肠道不同肠段的ph环境特点进行对特定区域样本取材。作者从15名健康人取材了240份样本,分析了细菌、噬菌体、宿主蛋白和代谢物之间的显著差异。通过16S rRNA gene sequencing分析了210例来自取材装置的样本, 29例唾液样本,58例粪便样本,描绘了不同区域微生物组成的空间异质性。

此外,作者还发现了细菌可以在装置里保持存活、prophage induction在肠道中增加。在蛋白质组学方面,作者用90min液相梯度(10%-30% bufferB)50cm色谱柱的液相装置结合Exploris 480,通过DDA采集模式分析了212个装置采集的样本和56个粪便样本的全蛋白质组的组成,鉴定到了2276人源蛋白(蛋白在样本中的NA%<70%),发现了粪便中和装置内的蛋白质组成不同。
https://www.nature.com/articles/s41586-023-05989-7
评述:孙耀庭

空间多组学数据分析

图源:论文截图

澳门大学Edwin Cheung团队今年初发表在Nucleic Acid Research的数据库专刊的文章-Aquila: a spatial omics database and analysis platform为目前快速发展的空间组技术提供了一个数据库和数据分析的方案。

空间组学通过将空间知识与转录本或蛋白质表达信息相结合来探索组织微环境和细胞网络。数据库囊括了空间转录组的最新技术,包括基于RNA 转录本原位杂交到索引序列的空间固定阵列上来捕获和保存组织的空间基因表达信息的尚未达到单细胞分辨率的Visium、单细胞的Slide-seq 和 DBiT-seq,和单细胞或亚细胞分辨率的 Stereo-seq、Seq-Scope 和 sci-Space 等技术;基于成像的空间转录组技术,通过荧光标记的探针以与已知的 RNA 目标杂交并需要超分辨率显微镜来捕获荧光信号,包括顺序荧光原位杂交 (seqFISH) 、多重错误稳健荧光原位杂交 (MERFISH)和空间分辨转录扩增子读出映射 (STARmap)技术。支持的空间蛋白质组技术与空间转录组相比,通量目前受到检测目标蛋白所需的荧光或金属偶联抗体的可用性而受到限制。该平台支持基于成像的循环免疫荧光和通过索引共检测技术,还有基于质量细胞计数的技术 imaging mass cytometry (IMC) 和质量离子束成像 (MIBI) 技术。

总而言之,Aquila目前拥有来自 15 种技术的30 种疾病的 107 个数据集和超过 1570 万细胞数据,提供2D 和 3D空间组学数据可视化,例如细胞图谱、表达图谱和标记物的共定位。用户既可以提交自己的空间组学数据在网页里分析,也可以作为应用程序安装在桌面上,还提供了RESTful API 服务以访问数据库。

Aquila 访问链接: https://aquila.cheunglab.org

https://academic.oup.com/nar/article/51/D1/D827/6761736

评述:张芳菲

基于质谱技术的体液蛋白质组学

图源:论文截图

2023年5月19日在MCP杂志上线的文章是来自Mann团队总结过去的五年基于质谱技术的体液蛋白质组学领域的工作以及未来发展。

基于质谱的蛋白质组学因其非靶向性、鉴定和定量的特异性成为生物标志物发现和常规测量的理想技术。这篇文章总结了基于质谱的蛋白质组方法的进展,包括增加的样品数量、鉴别深度和定量,独立验证的生物标志物候选物,增加机器学习或深度学习,在某些情况下,其性能已经超过了最先进的临床检测。更短的梯度、新的扫描模式和多通道即将大幅提高通量、跨研究整合和定量,包括绝对定量。

我们已经发现,多蛋白组合在本质上比目前的单蛋白质测试更稳健,更能捕捉人类表型的复杂性。虽然还有很多挑战,但前景光明。
https://www.mcponline.org/article/S1535-9476(23)00088-9/fulltext#secsectitle0120
评述:孙瑞

化学蛋白质组学+CRISPRi

图源:论文截图

2023年5月15日,麻省总医院癌症研究中心Liron Bar-Peled团队在Cell在线发表“Systematic identification of anticancer drug targets reveals a nucleus-to-mitochondria ROS-sensing pathway”。

该研究结合了基于半胱氨酸的化学蛋白质组学和功能基因组CRISPR筛选,对11种调节胞内ROS稳态的抗癌药物的功能蛋白靶点进行了全面描述。该研究基于iso-TMT鉴定半胱氨酸修饰确定了11种细胞毒性药物特异性和共同的ROS靶标(比如核糖体蛋白)。

对于每种药物,通过比较其半胱氨酸反应性与过氧化氢介导的半胱氨酸反应性的变化,发现auranofin(AUR)与过氧化氢靶点重叠程度最大。随后基于全基因组CRISPR干扰(CRISPRi)筛选,通过AUR与载体孵育富集的相应sgRNA之间的相对变化来计算CRISPRi评分,确定了51个介导抗性的基因和66个介导敏感性的基因。通过整合CRISPRi评分和给定靶标的半胱氨酸反应性变化计算 “优先级评分” 来确定AUR的ROS靶点的优先级。

同时基于相关靶点可能属于细胞网络的假设,将STRING定义的10个最接近的相互作用因子纳入优先级评分,并结合过氧化氢介导的半胱氨酸反应性,揭示了DNA损伤激酶CHK1是介导AUR敏感性所必需的,并且被过氧化氢进一步修饰。

通过进一步的验证实验,发现了

1)CHK1中的C408是一个核ROS传感器;

2)CHK1本身对抗核中过氧化水平的致命上升;

3)CHK1通过磷酸化SSBP1限制其线粒体定位来调节细胞核过氧化氢水平;

4)CHK1-SSBP1通路调节线粒体翻译控制细胞核过氧化氢水平。

在临床高级别浆液性卵巢癌队列中,作者发现低水平的SSBP1 mRNA和蛋白表达均与病人复发时间短相关。在卵巢癌细胞系中发现,SSBP1的敲低降低了顺铂调节的核过氧化氢水平,且对顺铂的敏感性降低;而且在顺铂耐药细胞系中也观察到了SSBP1蛋白相对非耐药株表达降低,提示SSBP1在铂获得性耐药中的作用。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.04.026
评述:钱鎏佳

小鼠组织的蛋白-蛋白相互作用

图源:论文截图

不列颠哥伦布亚大学的 Michael A. Skinnider和Leonard Foster 团队于2021年发表了7种小鼠组织的蛋白-蛋白相互作用(PPI)。

该工作利用体积排阻柱分离蛋白复合体,每种组织分为55个组分,两次生物重复。以同位素标记的老鼠(heavy)作为内参,1:0.75(light to heavy)比例混入每个组分,实现组分之间的可比性。

通过Maxquant软件得到蛋白表达矩阵,利用PrInCE程序包预测PPI(以稳定表达的CORUM数据库蛋白复合体真阳性)。该结果共预测出125696个PPI(每种组织中预测的PPI数目是在19804到35536之间),将已报道的PPI(82602个)扩增了约1.5倍。

不过作者发现,其与已报道的小鼠PPI相比,重合的部分并不多(只有4354个,占比2.1%),归结为两点原因:

1.已发现的小鼠PPI 较少;

2.现有的小鼠PPI是基于小规模的试验得出,与本文的工作具有互补性。

为验证这一观点,作者基于超几何分析,发现2.1%的比例并不是偶然现象。并且与人源样本大规模试验得出的结果相比,在已知PPI的发现率上较相似。并且作者还发现该工作结果与共洗脱试验得出的结果交集更多,而与酵母双杂交、交联方法得到的结果交集更少。而基于PDBbind数据库也发现,该工作得到的PPI并没有偏向亲和力强的PPI。

此外,该工作还对比了不同组织PPI的差异性。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.06.003
评述:刘志伟

同一活检样本的多组学分析方案

图源:论文截图

Mann团队进行了活检样本的平行多组学分析方法研究,预印本在2023年5月14日发布于bioRxiv。

他们对肿瘤活检样本经过Qiagen AllPrep试剂盒提取DNA、RNA后的流穿液进行基于质谱的蛋白质组、磷酸化蛋白质组分析,这些流穿液由丹麦Rigshospitalet医院在2016-2020年间获取并于-80℃条件保存。每份流穿液总量约800 μL,经过沉淀重悬,从其中的250 μL流穿液中得到了约50 μg蛋白质,用于蛋白质组学的样本制备。

在120 min梯度下,使用timsTOF Pro与DIA-NN分析27个BRAF-mutated(V600E)样本(上样量200 ng),单针鉴定量达到9173 protein groups(中位数)。使用Evosep和timsTOF SCP,在梯度缩短到44 min(每天30个样本)的情况下,仍可保持7607 protein groups的单针鉴定量,定量结果也与120 min梯度接近(Pearson r sq. = 0.97)。对于磷酸化蛋白质组分析,在70 min梯度下,使用Orbitrap Exploris 480与Spectronaut directDIA分析,从29-115 μg多肽中得到了2,101-10,492个磷酸化肽的定量数据。

他们的结果展示了对同一活检样本进行平行的多组学分析的可行性,并且肿瘤活检样本的蛋白质组在-80℃下可以保持至少5年的完整性,对蛋白质基因组学的临床应用提供了更理想的方案。
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.05.12.540582v1
评述:姜玟昊

♦ pepDESC

作者介绍了pepDESC,一种利用基于非标记定量质谱的单细胞蛋白质组学设计的肽水平信息检测差异表达蛋白质的方法,该方法利用肽段水平的信息,结合统计学方法,可以实现对单细胞中不同表达蛋白的高灵敏度检测。

作者先将单细胞进行裂解,获得蛋白质混合物,再使用LC-MS/MS进行质谱分析,获得大量的肽段信息。然后将肽段信息与已知的基因组和转录组信息进行比对和匹配,以确定每个肽段所对应的蛋白质。

通过比较不同细胞的蛋白质组数据,获得每个蛋白质在不同细胞中的表达量。采用了两种不同的统计学方法:基于贝叶斯统计学的方法和基于假设检验的方法。这两种方法都利用了肽段水平的信息,并考虑了多重比较的问题,以提高检测的准确性和可靠性。

该方法证明了其在单细胞蛋白质组学中的高效性和准确性,与传统的基于蛋白质水平的分析方法相比,具有更高的灵敏度和准确性,为单细胞蛋白质组学研究提供一种新的分析工具。
https://www.mcponline.org/article/S1535-9476(23)00094-4/fulltext
评述:薛张芝

肠道微生物多组学研究

图源:论文截图

Mann课题组参与的最新肠道微生物多组学的研究论文,5月10日在Nature杂志上线。

这篇论文的巧妙的点是,开发了一个ph依赖的取材装置,可以根据肠道不同肠段的ph环境特点进行对特定区域样本取材。作者从15名健康人取材了240份样本,分析了细菌、噬菌体、宿主蛋白和代谢物之间的显著差异。通过16S rRNA gene sequencing分析了210例来自取材装置的样本, 29例唾液样本,58例粪便样本,描绘了不同区域微生物组成的空间异质性。

此外,作者还发现了细菌可以在装置里保持存活、prophage induction在肠道中增加。在蛋白质组学方面,作者用90min液相梯度(10%-30% bufferB)50cm色谱柱的液相装置结合Exploris 480,通过DDA采集模式分析了212个装置采集的样本和56个粪便样本的全蛋白质组的组成,鉴定到了2276人源蛋白(蛋白在样本中的NA%<70%),发现了粪便中和装置内的蛋白质组成不同。
https://www.nature.com/articles/s41586-023-05989-7
评述:孙耀庭

空间多组学数据分析

图源:论文截图

澳门大学Edwin Cheung团队今年初发表在Nucleic Acid Research的数据库专刊的文章-Aquila: a spatial omics database and analysis platform为目前快速发展的空间组技术提供了一个数据库和数据分析的方案。

空间组学通过将空间知识与转录本或蛋白质表达信息相结合来探索组织微环境和细胞网络。数据库囊括了空间转录组的最新技术,包括基于RNA 转录本原位杂交到索引序列的空间固定阵列上来捕获和保存组织的空间基因表达信息的尚未达到单细胞分辨率的Visium、单细胞的Slide-seq 和 DBiT-seq,和单细胞或亚细胞分辨率的 Stereo-seq、Seq-Scope 和 sci-Space 等技术;基于成像的空间转录组技术,通过荧光标记的探针以与已知的 RNA 目标杂交并需要超分辨率显微镜来捕获荧光信号,包括顺序荧光原位杂交 (seqFISH) 、多重错误稳健荧光原位杂交 (MERFISH)和空间分辨转录扩增子读出映射 (STARmap)技术。支持的空间蛋白质组技术与空间转录组相比,通量目前受到检测目标蛋白所需的荧光或金属偶联抗体的可用性而受到限制。该平台支持基于成像的循环免疫荧光和通过索引共检测技术,还有基于质量细胞计数的技术 imaging mass cytometry (IMC) 和质量离子束成像 (MIBI) 技术。

总而言之,Aquila目前拥有来自 15 种技术的30 种疾病的 107 个数据集和超过 1570 万细胞数据,提供2D 和 3D空间组学数据可视化,例如细胞图谱、表达图谱和标记物的共定位。用户既可以提交自己的空间组学数据在网页里分析,也可以作为应用程序安装在桌面上,还提供了RESTful API 服务以访问数据库。

Aquila 访问链接: https://aquila.cheunglab.org

https://academic.oup.com/nar/article/51/D1/D827/6761736

评述:张芳菲

基于质谱技术的体液蛋白质组学

图源:论文截图

2023年5月19日在MCP杂志上线的文章是来自Mann团队总结过去的五年基于质谱技术的体液蛋白质组学领域的工作以及未来发展。

基于质谱的蛋白质组学因其非靶向性、鉴定和定量的特异性成为生物标志物发现和常规测量的理想技术。这篇文章总结了基于质谱的蛋白质组方法的进展,包括增加的样品数量、鉴别深度和定量,独立验证的生物标志物候选物,增加机器学习或深度学习,在某些情况下,其性能已经超过了最先进的临床检测。更短的梯度、新的扫描模式和多通道即将大幅提高通量、跨研究整合和定量,包括绝对定量。

我们已经发现,多蛋白组合在本质上比目前的单蛋白质测试更稳健,更能捕捉人类表型的复杂性。虽然还有很多挑战,但前景光明。
https://www.mcponline.org/article/S1535-9476(23)00088-9/fulltext#secsectitle0120
评述:孙瑞

化学蛋白质组学+CRISPRi

图源:论文截图

2023年5月15日,麻省总医院癌症研究中心Liron Bar-Peled团队在Cell在线发表“Systematic identification of anticancer drug targets reveals a nucleus-to-mitochondria ROS-sensing pathway”。

该研究结合了基于半胱氨酸的化学蛋白质组学和功能基因组CRISPR筛选,对11种调节胞内ROS稳态的抗癌药物的功能蛋白靶点进行了全面描述。该研究基于iso-TMT鉴定半胱氨酸修饰确定了11种细胞毒性药物特异性和共同的ROS靶标(比如核糖体蛋白)。

对于每种药物,通过比较其半胱氨酸反应性与过氧化氢介导的半胱氨酸反应性的变化,发现auranofin(AUR)与过氧化氢靶点重叠程度最大。随后基于全基因组CRISPR干扰(CRISPRi)筛选,通过AUR与载体孵育富集的相应sgRNA之间的相对变化来计算CRISPRi评分,确定了51个介导抗性的基因和66个介导敏感性的基因。通过整合CRISPRi评分和给定靶标的半胱氨酸反应性变化计算 “优先级评分” 来确定AUR的ROS靶点的优先级。

同时基于相关靶点可能属于细胞网络的假设,将STRING定义的10个最接近的相互作用因子纳入优先级评分,并结合过氧化氢介导的半胱氨酸反应性,揭示了DNA损伤激酶CHK1是介导AUR敏感性所必需的,并且被过氧化氢进一步修饰。

通过进一步的验证实验,发现了

1)CHK1中的C408是一个核ROS传感器;

2)CHK1本身对抗核中过氧化水平的致命上升;

3)CHK1通过磷酸化SSBP1限制其线粒体定位来调节细胞核过氧化氢水平;

4)CHK1-SSBP1通路调节线粒体翻译控制细胞核过氧化氢水平。

在临床高级别浆液性卵巢癌队列中,作者发现低水平的SSBP1 mRNA和蛋白表达均与病人复发时间短相关。在卵巢癌细胞系中发现,SSBP1的敲低降低了顺铂调节的核过氧化氢水平,且对顺铂的敏感性降低;而且在顺铂耐药细胞系中也观察到了SSBP1蛋白相对非耐药株表达降低,提示SSBP1在铂获得性耐药中的作用。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.04.026
评述:钱鎏佳

小鼠组织的蛋白-蛋白相互作用

图源:论文截图

不列颠哥伦布亚大学的 Michael A. Skinnider和Leonard Foster 团队于2021年发表了7种小鼠组织的蛋白-蛋白相互作用(PPI)。

该工作利用体积排阻柱分离蛋白复合体,每种组织分为55个组分,两次生物重复。以同位素标记的老鼠(heavy)作为内参,1:0.75(light to heavy)比例混入每个组分,实现组分之间的可比性。

通过Maxquant软件得到蛋白表达矩阵,利用PrInCE程序包预测PPI(以稳定表达的CORUM数据库蛋白复合体真阳性)。该结果共预测出125696个PPI(每种组织中预测的PPI数目是在19804到35536之间),将已报道的PPI(82602个)扩增了约1.5倍。

不过作者发现,其与已报道的小鼠PPI相比,重合的部分并不多(只有4354个,占比2.1%),归结为两点原因:

1.已发现的小鼠PPI 较少;

2.现有的小鼠PPI是基于小规模的试验得出,与本文的工作具有互补性。

为验证这一观点,作者基于超几何分析,发现2.1%的比例并不是偶然现象。并且与人源样本大规模试验得出的结果相比,在已知PPI的发现率上较相似。并且作者还发现该工作结果与共洗脱试验得出的结果交集更多,而与酵母双杂交、交联方法得到的结果交集更少。而基于PDBbind数据库也发现,该工作得到的PPI并没有偏向亲和力强的PPI。

此外,该工作还对比了不同组织PPI的差异性。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.06.003
评述:刘志伟

同一活检样本的多组学分析方案

图源:论文截图

Mann团队进行了活检样本的平行多组学分析方法研究,预印本在2023年5月14日发布于bioRxiv。

他们对肿瘤活检样本经过Qiagen AllPrep试剂盒提取DNA、RNA后的流穿液进行基于质谱的蛋白质组、磷酸化蛋白质组分析,这些流穿液由丹麦Rigshospitalet医院在2016-2020年间获取并于-80℃条件保存。每份流穿液总量约800 μL,经过沉淀重悬,从其中的250 μL流穿液中得到了约50 μg蛋白质,用于蛋白质组学的样本制备。

在120 min梯度下,使用timsTOF Pro与DIA-NN分析27个BRAF-mutated(V600E)样本(上样量200 ng),单针鉴定量达到9173 protein groups(中位数)。使用Evosep和timsTOF SCP,在梯度缩短到44 min(每天30个样本)的情况下,仍可保持7607 protein groups的单针鉴定量,定量结果也与120 min梯度接近(Pearson r sq. = 0.97)。对于磷酸化蛋白质组分析,在70 min梯度下,使用Orbitrap Exploris 480与Spectronaut directDIA分析,从29-115 μg多肽中得到了2,101-10,492个磷酸化肽的定量数据。

他们的结果展示了对同一活检样本进行平行的多组学分析的可行性,并且肿瘤活检样本的蛋白质组在-80℃下可以保持至少5年的完整性,对蛋白质基因组学的临床应用提供了更理想的方案。
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.05.12.540582v1
评述:姜玟昊

♦ pepDESC

作者介绍了pepDESC,一种利用基于非标记定量质谱的单细胞蛋白质组学设计的肽水平信息检测差异表达蛋白质的方法,该方法利用肽段水平的信息,结合统计学方法,可以实现对单细胞中不同表达蛋白的高灵敏度检测。

作者先将单细胞进行裂解,获得蛋白质混合物,再使用LC-MS/MS进行质谱分析,获得大量的肽段信息。然后将肽段信息与已知的基因组和转录组信息进行比对和匹配,以确定每个肽段所对应的蛋白质。

通过比较不同细胞的蛋白质组数据,获得每个蛋白质在不同细胞中的表达量。采用了两种不同的统计学方法:基于贝叶斯统计学的方法和基于假设检验的方法。这两种方法都利用了肽段水平的信息,并考虑了多重比较的问题,以提高检测的准确性和可靠性。

该方法证明了其在单细胞蛋白质组学中的高效性和准确性,与传统的基于蛋白质水平的分析方法相比,具有更高的灵敏度和准确性,为单细胞蛋白质组学研究提供一种新的分析工具。
https://www.mcponline.org/article/S1535-9476(23)00094-4/fulltext
评述:薛张芝
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