蛋白质组学视角下的「致命」红斑狼疮

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      系统性红斑狼疮( systemic lupus erythematosus,SLE) 是一种常见的自身免疫性疾病,起病隐匿,临床表现复杂,诊断困难,治疗受限,且多发于育龄期女性。
      SLE常表现为复发加重与缓解交替进行的病程。可侵犯大多数的组织器官,包括心、脑、皮肤、关节和肾脏等。其中,狼疮肾炎( Lupus nephri-tis,LN) 是系统性红斑狼疮最常见且严重的并发症,也是导致SLE患者死亡的主要原因之一。
      尽管对SLE的研究已较深入,但其却确的病因学及病理机制还知之甚少。因此迫切需要发现隐藏于疾病背后的确切病理机制,找到新的、更加敏感而特异的生物标志物,发现药物治疗新靶点。
      近年来,蛋白质组学技术的出现为研究自身免疫性疾病提供了新的视角,其被广泛应用于系统性红斑狼疮疾病的相关研究中,包括阐明其病理生理机制,辅助疾病早期诊断,寻找新的诊断用生物标志物以及发现可能的药物作用靶标。


中性粒细胞的失调可能在系统性红斑狼疮的发病机制中发挥关键作用。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)的过度释放(即氧化核酸和颗粒蛋白的外部化)促进了与SLE相关的免疫失调、血管病理和器官损伤。低密度粒细胞(LDGs)是SLE患者中增多的促炎性中性粒细胞亚群,与正常的中性粒细胞相比具有更强诱导NETs形成的能力,在SLE发病机制中起着重要作用。

之前的LDG研究主要集中在转录组分析上,关于蛋白质组的调控和蛋白质功能知之甚少。

2020年9月28日,美国国立卫生研究院的 Mariana J Kaplan 团队在 Annals of the Rheumatic Diseases(IF=27)发表蛋白组学研究文章 Proteomic, biomechanical and functional analyses define neutrophil heterogeneity in systemic lupus erythematosus

图1 论文截图

文章通过蛋白质、生物力学和功能分析,深入研究了系统性红斑狼疮患者中的低密度粒细胞,揭示了它们在蛋白质表达、生物力学特性和微血管行为方面的异质性,为深入理解红斑狼疮病理机制提供了重要线索。

 

实验方法


研究采用蛋白质/磷酸蛋白质组学分析对健康对照(HC)正常密度中性粒细胞(NDNs)、SLE NDNs和同源SLE LDGs进行了分析。通过实时变形度流式细胞术和光片显微镜对这些中性粒细胞亚群的生物物理特性进行了分析。通过二维内皮细胞流系统和三维微流体微血管模拟器(MMM)来解耦细胞表面介质和生物物理特性对中性粒细胞迁移的贡献。


实验结果


1. 红斑狼疮和健康对照中性粒细胞的差异蛋白质表达

研究首先通过对SLE LDGs和NDNs以及HC NDNs的蛋白质/磷酸化蛋白质进行分析,发现SLE和HC中性粒细胞之间存在显著的差异。

中性粒细胞质谱分析鉴定了4109个蛋白质,其中14.6%(601种)和16.6%(685种)分别仅在HC或SLE中性粒细胞中存在。对比SLE LDGs和NDNs,发现它们具有完全重叠的蛋白质组,但在蛋白质的丰度上存在明显的变异。SLE中性粒细胞中有9.4%的蛋白质在SLE LDGs和NDNs之间存在差异表达,其中270个蛋白质的丰度较高,60个蛋白质的丰度较低。

图2 与健康对照(HC)正常密度中性粒细胞(NDNs)相比,系统性红斑狼疮(SLE)正常密度中性粒细胞(NDNs)在其蛋白质组和磷酸化组上存在差异。

此外,研究还发现了与蛋白质丰度有关的磷酸化差异,支持中性粒细胞蛋白质组存在差异性。

 

2. 低密度粒细胞(LDGs)具有独特的蛋白质组学特征

通过生物信息学工具的分析,发现在SLE NDNs相对于HC NDNs中丰度更高的蛋白质主要涉及中性粒细胞活化网络,包括促使细胞迁移到炎症部位和从骨髓释放的蛋白质。而与中性粒细胞活化相关的一些蛋白质在SLE LDGs中最为丰富。

与此同时,SLE患者表达了在各种器官和细胞中上调的I型干扰素刺激基因(ISGs)。虽然ISG编码蛋白在SLE NDNs中的上调程度不一致,但在SLE LDGs相对于SLE或HC NDNs中,很多ISG编码蛋白上调。这表明SLE中性粒细胞的蛋白质组呈现出激活状态,而与IFN相关的蛋白特征在SLE LDGs中是独特的。

 

3. SLE LDGs和NDNs在细胞骨架相关蛋白表达上存在差异

与之前的转录组分析一致,SLE LDGs在蛋白水平上表现出与细胞骨架相关的转录网络的上调。与研究相对应的蛋白质差异表达和/或磷酸化的LDGs调节细胞内运输,而fMLF-primed HC NDNs的磷酸化蛋白与细胞骨架组织相关。这表明SLE LDGs与NDNs在细胞骨架调节方面存在差异,推动了对中性粒细胞生物力学特性的进一步研究。

图3 蛋白质组学和磷酸蛋白组学分析显示,在SLE正常密度中性粒细胞(NDNs)和低密度粒细胞(LDGs)之间存在与细胞骨架功能相关的蛋白质表达差异。

 

4. 临床活跃期SLE患者中性粒细胞的生物力学性质发生改变

通过实时变形性流式细胞术(RT-DC)分析,发现活跃SLE患者的中性粒细胞在生物力学上显示出不同于HC和临床静息SLE患者的特性,包括较大的面积、增强的可变形性和粗糙度。这表明SLE患者的中性粒细胞在临床活跃期间存在生物力学上的变化。

图4 系统性红斑狼疮(SLE)低密度粒细胞(LDGs)在实时变形性流式细胞术(RT-DC)中的生物力学表现比其他中性粒细胞亚群更为粗糙。

 

5. SLE LDGs和NDNs在生物力学上有差异

通过优化的纯化策略,研究人员研究了SLE LDGs/NDNs和HC NDNs的生物力学特性。结果显示,SLE LDGs相对于其他中性粒细胞亚群具有独特的生物力学特征,表现为粗糙的细胞表面。与HC中性粒细胞相比,SLE LDGs具有显著的生物力学差异,这种差异与其特有的细胞表面形态无关。

 

6. SLE LDGs 在微流体微血管模拟中滞留

研究通过使用微流体芯片模拟肺部微血管中性粒细胞的通过,发现SLE LDGs相对于SLE NDNs更容易被滞留。这种滞留与细胞的生物力学特性有关,而不是特定的中性粒细胞-内皮细胞相互作用。这表明SLE LDGs可能由于其细胞生物力学特性的内在改变而在微血管网络中滞留,这与它们与内皮细胞的黏附能力无关。

图5 SLE LDGs 在三维肺微血管模拟系统中逐渐滞留,但在二维流动系统中并未显示对内皮细胞的增强附着能力。


研究表明,在中性粒细胞蛋白质组的调控和生物物理特性的不同变化中,存在中性粒细胞的异质性。研究提出了一种假设,即 SLE LDGs 可能在微血管网络中更易滞留,这可能对红斑狼疮肺或肾损伤以及小血管病理的发展具有重要的病理学意义。

总体而言,这些研究结果揭示了SLE患者中性粒细胞的多方面差异,涉及蛋白质表达、磷酸化、细胞生物力学和在微血管中的行为,特别是SLE LDGs可能通过其独特的生物学特性在疾病发展中发挥重要作用。

文献链接:

https://ard.bmj.com/content/80/2/209

 

延伸阅读—— 红斑狼疮的蛋白质组学研究

1 October 2023 Clinical Immunology
转录组学和蛋白质组学分析揭示系统性红斑狼疮中外周非典型单核细胞的独特病理特征

研究通过对系统性红斑狼疮(SLE)患者和健康个体的三种单核细胞亚群进行蛋白质组学和转录组学分析,揭示了活跃SLE患者外周非经典单核细胞(NCM)的病理特征。研究发现SLE NCM表现出炎性特征,具有I型干扰素(IFN)特征、补体和p53信号通路的激活,以及代谢紊乱、氧化磷酸化减弱和DNA修复改变。实验证明,在SLE中,NCM的病理性表现主要表现为增强的DNA损伤修复、p53炎症反应、G0细胞周期阻滞和启动分化程序,导致自噬增强和M1巨噬细胞极化。研究还发现,增强的自噬可能通过防止SLE NCM凋亡并支持偏向分化来推动这一过程。

链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661623005284?via%3Dihub


2 January 30, 2023 Heliyon
系统性红斑狼疮患者血浆中外泌体 miRNA 和蛋白的差异表达

研究通过RNA测序和蛋白质组学方法,分析了系统性红斑狼疮(SLE)患者和健康受试者血浆中外泌体miRNAs和蛋白质的表达差异。研究发现在SLE患者血浆中有一组不同ially expressed的外泌体miRNAs和蛋白质。研究人员识别出一致性的分子(39个miRNAs,14个蛋白质)和21个共同的信号通路,这些在当前研究和先前的研究中都得到验证。通过比较这些结果与以前报道的其他循环组分数据,研究指出这些共享的分子和通路可能对SLE的临床治疗和诊断具有潜在应用。

链接:https://www.cell.com/heliyon/fulltext/S2405-8440(23)00552-2


3 Oct 27, 2022 Molecular & Cellular Proteomics
全局磷酸蛋白质组学揭示了在系统性红斑狼疮中受激酶调控的网络

研究使用高通量磷蛋白质组学和生物信息学方法,全面揭示了系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单核细胞的全局磷蛋白组学图谱,包括缓解期、活动期的SLE患者、类风湿性关节炎患者和健康对照。研究发现,在SLE患者中,磷酸化上调显著,并导致细胞黏附和迁移特征的非典型富集。通过4D-非标记定量法鉴定了特异上调的磷酸化位点,揭示了SLE中的关键激酶和激酶调控网络,并通过平行反应监测法进行了验证。这些发现为深入了解SLE的分子机制提供了基础,同时全球磷蛋白质组学图谱为寻找潜在治疗靶点提供了重要参考。

链接:https://www.mcponline.org/article/S1535-9476(22)00242-0/fulltext

 

4 October 19, 2022 Frontiers In Immunology
狼疮易感小鼠骨髓源性巨噬细胞的内源性免疫记忆机制

这项研究通过对狼疮易感MRL/lpr小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)进行IFN-γ和脂多糖(LPS)的二次刺激,揭示了先前刺激的巨噬细胞中特定的内源性免疫记忆基因(ISGs)显著上调。通过RNA-seq和TMT蛋白质组学分析,研究者发现上调的基因富集在防御和内源性免疫反应领域,与巨噬细胞中的模式识别受体(PRRs)相关的途径有关。研究还表明,在MRL/lpr小鼠中,经二次刺激后,先天免疫细胞中的PRRs表达发生改变,激活了IFN相关途径,释放大量ISGs促进二次响应。同时,代谢途径如糖酵解得到增强,可能发生表观遗传学变化。

链接:https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.1004232/full

 

5 June 21, 2022 Frontiers in Immunology
蛋白组学揭示红斑狼疮男性患者中性粒细胞激活水平高于女性

研究旨在探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者男女性别差异的潜在机制。研究人员采集了来自15名SLE患者(7名男性,8名女性)和15名年龄匹配的健康对照者(7名男性,8名女性)的外周血单个核细胞(PBMC)进行蛋白质组学分析。结果显示在SLE男女患者中,尽管存在共同的I型干扰素信号激活,但男性SLE患者中中性粒细胞激活水平更高。Western blot验证表明,与女性SLE相比,男性SLE中参与中性粒细胞激活的PGAM1、BST2和SERPINB10蛋白的表达水平更高。此外,男性SLE中中性粒细胞激活和反应性氧化物水平也较女性SLE明显增加。研究的结论是I型干扰素激活是男女SLE共同的标志,而中性粒细胞激活在男性SLE中更为显著。

链接:https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.911997/full

 

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